1 、样本准备：

1）石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min ，蒸馏水洗。

2）冰冻切片：冰冻切片固定 10-30min，PBS 洗 5min，重复 3 次，滴加 0.3%triton-X100 破膜液通透 20min，PBS 洗 5min ，重复 3 次。

3）细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定 10-30min，PBS洗5min重复 3 次，滴加 0.3% triton-X100 破膜液通透20min，PBS 洗 5min ，重复 3 次。

2、抗原修复：

组织切片置于盛满 PH 9.0 EDTA 碱性抗原修复液或者 PH6.0 柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于 微波炉内进行抗原修复中火 8min ，停火 8min ，转中低火 7min。自然冷却后将玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。

(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，冰冻切片和细胞样本可省略此步骤）。

3 、阻断内源性过氧化物酶：

切片放入 3%过氧化氢溶液，室温避光孵育 15 min ，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min。

4 、非特异性靶点封闭:

切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭 30min 。

5 、加一抗：

轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗 ，切片平放于避光湿盒内 4°C孵育过夜或者 37℃1-2h（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。

6 、加HRP二抗：

玻片置于 PBS（PH7.4） 中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次5min 。切片稍甩干后在圈内 滴加与一抗相应种属的HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育 50min ，PBS 洗三次。

7 、TSA 荧光染料反应液反应：

浓缩型荧光染料与 TSA buffer 按照 1:50- 1:200 的比例混合均匀，

切片滴加配好的 TSA 荧光染料反应液均匀覆盖组织室温反应 1- 15min（最佳时间 5min- 10min），PBS 洗三次（预实验先染 1min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步）。

8 、抗体洗脱：

石蜡切片置于抗原修复液中 95 度水浴 25-40min（根据不同抗体亲和力 灵活调整时间）或者滴加适量在37℃预热至完全溶解的mIHC 专用抗体洗脱液（冰冻切片 爬片 骨组织建议用）覆盖样本，37 度放置 5-20 分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本 37 度放置 5-20 分钟，弃洗脱液，PBS 洗三次，每次 5 分钟（石蜡切片用热修复洗脱或者抗体洗脱液洗脱，细胞及冰切切片用抗体洗脱液进行洗脱）

9 、 重复 3-8 步骤（换用另外一种 TYR-XXXPLus  荧光染料）---第2~N 轮标记

10 、重复 3-7 步骤（换用另外一种 TYR-XXXPLus  荧光染料）---第N轮标记

11、DAPI 复染细胞核：

玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后在圈内滴加 DAPI 即用型染液，避光室温孵育 5min-20min。

12 、封片：

玻片置于 PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤 3 次，每次 5min 。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片（我司有相应产品，此处直接给出货号）。

13 、镜检拍照：

切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

以下是使用慧蓝生物多重荧光染色Plus试剂盒成像示例：

（A）人输卵管组织指标A（570黄）＋指标B（520绿）＋指标C（690粉）；

（B）小鼠肾组织指标A（570黄）＋指标B（520绿）＋指标C（690粉）;

（C）人胃癌肿瘤指标A（690粉）＋指标B（620红）＋指标C（570黄）＋指标D（520绿）;

（D）人肠组织指标A (570黄)＋指标B (520绿) ＋指标C(690粉) ＋指标D(620红) ＋指标E(480青)。