Q1.怎么判断脱钙完成？

①针刺法：用细针轻戳组织，若针能轻松刺入且无阻力，提示脱钙完全；若感觉坚硬或需用力，则需继续脱钙。

②弯曲法：手触碰骨组织有弹性能轻易弯折时即判断为脱钙终完全。

Q2.骨组织染色背景过高的原因？

①固定不充分或过度固定（原因：固定不足会导致抗原扩散，过度固定可能引起非特异性结合。解决：优化固定时间（通常4%多聚甲醛24小时内），避免使用酸性脱钙液破坏抗原。）

②脱钙处理（原因：强酸脱钙液（如盐酸、硝酸）可能破坏抗原表位或增加非特异性结合。解决：改用EDTA脱钙液。）

③抗体浓度过高(原因：抗体浓度过高导致背景过高。解决：降低抗体浓度。）

④显色问题（原因：TYR染料显色时间过长。解决：建议先显色5min为主，信号弱可延长显色时间。）

Q3.为什么骨组织染色不均匀？

①固定不充分或过度固定（原因：固定不足会导致抗原降解，而过度固定可能掩盖抗原表位，影响抗体结合。解决：优化固定时间，建议固定24-48h）

②脱钙处理不当（原因：强酸脱钙易破坏蛋白抗原性，导致染色不均。解决：使用温和的EDTA脱钙。）

③切片厚度不均或损伤（原因：骨组织硬度高，切片时易产生裂纹或厚度不均，导致荧光信号差异。解决：延长蜡块冷冻时间，优化切片技术。）

④非特异结合（原因：骨组织富含胶原和矿物质，易引起抗体非特异性吸附。解决：增加封闭步骤，或添加去垢剂增强渗透。）

Q4.染骨组织边缘着色是为什么？

①抗体渗透问题（原因：骨组织致密，抗体难以渗透到内部，导致边缘结合更多抗体。解决:优化脱钙流程、增加抗体孵育时间或使用穿透增强剂。）

②组织固定或处理不当（原因：固定不足，边缘固定较好而内部未充分固定，导致内部抗原丢失。过度固定，抗原表位被遮蔽，边缘因接触固定剂较少而保留更多抗原。）

③干片（原因：高浓度抗体易在边缘滞留，形成梯度渗透。解决：组化圈画大一点，试剂均匀覆盖组织。）

Q5.骨组织多标可以做哪些分析？

①阳性率 ②共标率 ③平均光密度 ④空间分析等

Q6.骨头可以做哪些染色？

①番红固绿染色（嗜碱性的软骨和碱性染料番红O结合呈现红色，嗜酸性的骨和酸性染料固绿结合而成绿色或者蓝色。）

②茜素红染色（钙离子与茜素红螯合,被染成红色或者紫红色。）

③TRAP染色（破骨细胞呈红色或紫红色。）等

Q7.我们做不做ALP/TRAP染色？

不做ALP染色，没有染料。可以做TRAP染色，破骨细胞呈红色或紫红色。

Q8.番红固绿染不上色是什么原因？

①染色时间或浓度不当：

番红染色时间不足（如5分钟可能太短，建议延长至10-30分钟或过夜）。番红浓度过低（通常使用0.1%-1%的番红O溶液）。固绿染色：固绿染色时间过短（如仅15秒可能不足，建议1-3分钟）。

固绿分化过度（如酒精脱水时间过长可能导致固绿褪色。）

②组织特性影响：

（原因：某些组织可能因木质素或蛋白多糖含量低，导致番红染色弱。解决：延长番红染色时间。）

③试剂质量问题：

（原因：染料失效或配制不当，如番红O或固绿过期、pH值不合适。解决：使用新鲜配制的染液，避免存放过久。检查染液pH，番红适合弱酸性至中性，固绿适合弱酸性。）

Q9.兔子股骨怎么固定，有什么注意事项？

先固定几个小时，然后分割后再固定，不然中间部分容易固定不彻底，总固定时间在24-48小时。

Q10.成骨细胞/破骨细胞你们常用标记物有哪些?

成骨细胞常见标记物：

①RUNX2：转录因子，调控成骨分化的关键基因，是成骨细胞分化的最早标志之一。

②Osterix（SP7）：RUNX2下游的转录因子，对成骨前体细胞向成熟成骨细胞分化至关重要。

③Ⅰ型胶原（COL1A1/COL1A2）：骨基质的主要成分，分泌旺盛期成骨细胞的标志。

④骨钙素（OCN, Osteocalcin）：晚期标志物，在矿化阶段分泌，与羟基磷灰石结合。

⑤骨桥蛋白（OPN, Osteopontin）：参与矿化和细胞黏附的分泌蛋白。

破骨细胞常见标记物：

①MMP-9（基质金属蛋白酶9）：参与细胞外基质降解，促进骨吸收。

②RANK（Receptor Activator of NF-κB）：破骨细胞分化的关键受体，与RANKL结合后激活下游信号通路。

③CD44：参与破骨细胞与骨基质的黏附。

Q11.大鼠牙组织脱钙用快速脱钙液要脱多久？有没有缩短脱钙时间的方法？

酸性脱钙液（如10%甲酸、硝酸或盐酸-甲酸混合液）：大鼠磨牙或切牙通常需要 12-24小时（小型牙）至 24-48小时（较大样本），需定期检查。

缩短脱钙的方法：

①超声波辅助脱钙：超声处理（30-60分钟）可加速脱钙，但需控制频率避免组织碎裂。

②热脱钙液：37°C可缩短时间。

Q12.骨组织如何做TSA染色？

骨组织相对于常规组织要注意两点：

①抗原修复：骨组织易掉片，不能用传统的微波或者95℃去水浴修复。建议EDTA或柠檬酸修复液60℃水浴修复30-45min。

②抗体洗脱：为了降低脱片风险，需用到我司专用抗体洗脱液，7min两次进行抗体洗脱。有一些抗体结合比较强难以洗脱的可以抗体洗脱液+EDTA或柠檬酸60℃洗脱加强洗脱。

Q13.骨组织抗体未洗脱干净会串色，怎么去改善？

延长抗体洗脱液洗脱时间/抗体洗脱液+EDTA或柠檬酸60℃洗脱。

Q14.骨组织硝酸脱钙之后会影响IHC吗？

硝酸作为强酸会破坏抗原和细胞核，建议以EDTA碱性脱钙液，适当在37℃加热缩短脱钙时间。

Q15.骨组织容易掉片？

适当降低修复强度，用相对比较温和的柠檬酸抗原修复液，如果在多重免疫荧光抗体洗脱时脱片，可以使用我司mIHC专用的抗体洗脱液。

如有任何疑问，请随时通过以下方式联系我们的客服团队：

技术支持：  13026142229； 18371210073

销售&售后：19101712317；13026142229

服务热线 ： 021-58153560

慧蓝生物公众号： 慧蓝生物客服微信：

**慧蓝生物，不止于服务**