在癌症治疗领域，肿瘤微环境中的免疫细胞“根据地”——三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures，TLS）近年来备受关注。

这些结构不仅是免疫细胞的聚集地，更是预测患者预后和免疫治疗响应的关键指标。

在今年二月发表的《非小细胞肺癌三级淋巴结构专家共识》中也指出：

1.推荐选择6-7个合适的指标来检测三级淋巴结构——意味着多指标染色已成为主流检测发展趋势

2、共识七中还指出推荐有条件的医疗结构，使用mIHC来定量分析三级淋巴结构的密度、大小和数量等。

共识文件中指出：mIHC/mIF技术在保证分辨率的同时可兼顾全景成像,凭借视场大、颜色多、通量高的特点，

可在短时间内原位检测整张组织切片上的多种生物标志物的表达情况,借以识别组织上每个细胞表型、丰度、状态及其相互关系。

 

然而，传统 TLS 量化方法存在操作繁琐、主观性强、精度不足等痛点，严重制约了其在临床和科研中的应用。

近日，Sarah Ghamry - Barrin 等学者在《Tertiary Lymphoid Structures: Methods and Protocols》中，

提出了一套结合 7 重免疫荧光染色与 HALO - AI 自动化分析的完整方案，为人类肿瘤样本中 TLS 的精准量化提供了标准化路径。

今天就带大家深度拆解这篇极具实操价值的文献！

一、研究背景：为何聚焦 TLS 量化？

TLS 是肿瘤组织中由免疫细胞异位聚集形成的临时性淋巴样结构，其核心功能是驱动局部抗肿瘤免疫反应 ——

结构中包含 B 细胞区（含生发中心、滤泡树突状细胞 FDC）、T 细胞富集区（含成熟树突状细胞 mDC），

部分成熟 TLS 还伴随高内皮小静脉（HEV），可招募外周免疫细胞。

已有研究证实，在非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤、乳腺癌等多种实体瘤中，

TLS 密度越高，患者长期生存率越高，且对免疫检查点抑制剂治疗的应答率也显著提升 。

但长期以来，TLS 量化面临两大核心难题：

一是细胞识别难，TLS 包含多种细胞亚型，传统染色难以同时精准标记；

二是分析标准化难，人工计数易受观察者经验影响，无法实现大规模样本的统一分析。

为此，该研究针对性开发了 “染色 - 分析” 全流程方案，填补了技术空白。

 

二、关键技术路径：从染色到分析的 “全链条突破”

 七重免疫荧光染色：TSA 技术撑起精准标记

研究采用酪酰胺信号放大（TSA）技术，解决了多重免疫荧光染色中信号弱、抗体交叉反应的难题。

1、核心原理：通过辣根过氧化物酶（HRP）激活酪酰胺，使其与组织蛋白共价结合，信号稳定且可耐受高温抗体剥离，实现同一组织切片的多轮标记。

 

2、染色核心靶点：涵盖 TLS 关键组分与肿瘤细胞，研究团队采用TSA技术，实现了在同一组织切片上同时标记6种TLS相关细胞类型：

• CD20+ B细胞（橙色）

• CD3+ T细胞（蓝色）

• pan-Cytokeratins+ 肿瘤细胞（灰色）

• CD21+ 滤泡树突状细胞（黄色）

• DC-LAMP+ 成熟树突状细胞（浅绿色）

• PNAd+ 高内皮小静脉（红色）

 

3、染色流程：从样本脱蜡、抗原修复，到内源性过氧化物酶封闭、抗体孵育，再到 TSA 标记与抗体剥离，重复多轮后完成 7 重标记，最后封片干燥，全程严格控制温度与孵育时间，确保信号稳定。

 

4、实验结果与图片解析：从可视化到量化验证

这是该研究中最具代表性的结果图，展示了非小细胞肺癌样本中TLS的完整结构。

图a为DAPI核染色（白色），显示细胞分布；图c-h分别显示6种细胞类型的空间分布：

• 图c：CD20+ B细胞（紫色）形成密集聚集区

• 图d：CD3+ T细胞（橙色）围绕在B细胞区周围

• 图e：pan-Cytokeratins+ 肿瘤细胞（黄色）位于TLS外围

• 图f：CD21+ 滤泡树突状细胞（蓝色）在B细胞区内形成网络

• 图g：DC-LAMP+ 成熟树突状细胞（粉色）位于T-B细胞交界区

• 图h：PNAd+ 高内皮小静脉（红色）为TLS提供营养支持

图b为6种标记物的叠加图像，清晰展示了TLS的复杂空间组织。这种多色可视化不仅美观，更重要的是为后续的AI分析提供了高质量的数据基础。

 

三、关键突破：HALO-AI 自动化分析流程

若说染色是 “基础”，AI 分析则是 “核心”。研究构建了分层递进的 HALO-AI 分析体系，所有算法需通过＞85% 准确率验证

（视觉对比分割结果与原始图像一致性），确保量化结果可靠 。

流程分为 5 大关键步骤：

1. 区域标注（ROI）

首先圈定 “感兴趣区域”，涵盖肿瘤、间质及 TLS 区域，同时排除无组织区、坏死灶、红细胞等干扰项

—— 后续分析仅针对 ROI 进行，减少无关信号影响。

2. 组织分割：区分 “关键组织类型”

采用 MiniNet 算法（适合＜100 样本的小队列，快速且稳健），将样本分为 5 类：

无组织区（玻璃）、间质、人工伪影（坏死、灰尘等）、TLS、肿瘤。

训练时需覆盖样本异质性（如不同 TLS 成熟度、肿瘤浸润程度），确保算法能精准区分 “分散免疫细胞” 与 “结构化 TLS”。

3. 细胞核 / 细胞分割：精准识别单个细胞

• 基础分割：基于 DAPI 染色识别圆形细胞核；
• 特殊细胞优化：针对长形细胞（如 HEV 细胞）、大型细胞（如肿瘤细胞），额外加入 CD21、泛细胞角蛋白等通道辅助分割，避免漏检或误判 ；
• 验证标准：需标注＞2000-3000 个不同形态细胞核，确保算法覆盖细胞异质性。

4. 表型分析：多方案灵活适配研究需求

研究提供 3 种表型分析方案，可根据样本复杂度与数据需求选择：

• 方案 1：AI 目标表型法：通过 “示例训练” 识别细胞类型（如 CD3⁺T 细胞、CD20⁺B 细胞），优势是稳健性强，缺点是无荧光强度数据；
• 方案 2：HighPlex FL 阈值法：基于荧光强度阈值区分细胞表型，可获取平均荧光强度，适合无 AI 训练经验的场景 ；
• 方案 3：AI+HighPlex FL 组合法：融合两种方法优势，同时获取细胞类型、荧光强度、组织定位数据，是研究推荐的最优方案。

5. 空间分析与数据导出

• 空间分析：基于细胞 XY 坐标，可开展 4 类分析 —— 最近邻分析（如 mDC 与 T 细胞的距离）、邻近性分析（如 HEV 周围 10μm 内 T 细胞数量）、浸润分析（T 细胞向肿瘤巢的浸润程度）、密度热图（B 细胞在 TLS 内外的密度对比）；
• 数据输出：生成单细胞数据（细胞 ID、坐标、表型）与汇总数据（组织面积、细胞计数、百分比），支持.csv 或.fsc 格式导出，方便后续统计分析。

 

这张图详细说明了AI分析的具体流程。从左到右包括：

• 多色免疫荧光图像和对应的H&E染色图像导入

• 定义感兴趣区域（ROA）

• AI算法训练和优化（准确率>85%）

• 组织类别检测（肿瘤、基质、TLS）

• 细胞核和细胞分割

• 细胞表型分析

• 最终生成定量数据并执行空间分析

 

四、研究价值：开启 TLS 量化的 “标准化时代”

该方案的发表，为肿瘤免疫研究提供了三大核心价值：

1. 标准化：统一 FFPE 样本的染色流程与 AI 分析参数，减少实验室间差异，使 TLS 量化结果具备可比性；
2. 高效化：AI 自动化分析替代人工计数，支持大规模临床队列（如数百例样本）的批量处理，大幅提升研究效率；
3. 精准化：同时实现 “细胞类型识别、TLS 成熟度判断、细胞空间互作分析”，为解析 TLS 调控机制、筛选免疫治疗获益人群提供更精细的工具。

未来，该方案可推广至肺癌、黑色素瘤、结直肠癌等多种实体瘤研究，甚至为 “靶向 TLS 的新型免疫疗法开发” 提供技术支撑，推动肿瘤免疫研究从 “定性描述” 向 “定量解析” 迈进。

 

参考文献：

Ghamry-Barrin S, et al. Automated Quantification of Tertiary Lymphoid Structures in Human Tumor Samples Using Immunofluorescence and AI-Powered Analysis Pipeline. Methods Mol Biol. 2025;2864:205-229.

 

技术延伸应用：从TLS分析到多组织研究平台

值得一提的是，本文献提出的多重免疫荧光染色（基于酪胺信号放大技术）与AI图像分析相结合的方案，

其应用价值远不止于三级淋巴结构（TLS）研究。这一技术平台具有高度的通用性和可扩展性，可广泛应用于多种组织和疾病模型的分析：

1、肿瘤免疫微环境：除TLS外，还可用于肿瘤浸润淋巴细胞、免疫抑制细胞群落等的空间分析

2、神经科学研究：适用于脑组织中不同神经细胞类型的同时标记和分布研究

3、炎症性疾病：可用于慢性炎症组织中免疫细胞浸润模式的定量分析

4、发育生物学：研究胚胎发育过程中不同细胞谱系的空间时序变化

 

专业技术服务支持：上海慧蓝生物科技有限公司

上海慧蓝生物科技有限公司可提供专业的一站式多重免疫荧光整体解决方案，为研究人员提供从实验到分析的完整技术支持：

产品与服务矩阵：

• 实验试剂：提供多种验证合格的mIHC抗体、TSA试剂盒及相关耗材

• 成像设备：配备先进的多通道荧光显微镜和高通量扫描仪

• 分析服务：提供从基础定量到高阶空间分析的全面数据处理服务

• 技术咨询：资深技术团队提供实验设计、方案优化等专业支持

技术优势体现：

• 采用与文献相似的TSA信号放大技术，确保检测灵敏度

• 多重标记能力支持10+靶标同时检测，提高数据维度

• AI驱动分析管道实现精准的细胞识别、分类和空间关系量化

• 标准化流程保证结果的可重复性和可靠性

 

 

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