做 TSA 多重荧光 mIHC 实验令人崩溃的环节：

多标串色、切片成片掉片、抗原丢失、DAPI 染核变浅

80% 问题根源全在抗体洗脱选错方法！

很多人分不清热洗脱/专用洗脱液，石蜡、冰冻、细胞混用一套操作，实验直接报废！！！

今天一次性分清3种样本专属洗脱方案，彻底解决不会选洗脱液的痛点！

一、先搞懂洗脱底层逻辑

TSA核心机制：酪胺荧光素与组织蛋白共价牢固结合，但一抗+HRP二抗仅为非共价结合

洗脱的唯一目的：彻底洗掉上一轮一抗二抗，完整保留荧光信号，才能循环孵育同源一抗做多色标记

慧蓝试剂盒提供两套洗脱方案，样本类型直接决定选择：

1、95℃柠檬酸 pH6.0 热修复水浴洗脱（强洗脱力度）

2、mIHC 专用抗体洗脱液 RC-010（温和化学洗脱）

 

二、三大样本｜专属洗脱方式对照表

石蜡组织切片｜首推：95℃水浴热洗脱

适配：肿瘤石蜡、脏器石蜡、硬质包埋 FFPE 组织

✅标准操作步骤

1、柠檬酸 pH6.0 修复液水浴预热稳定 95℃

2、切片完全浸入液体，95℃水浴 25–40min

普通亲和力一抗：25min

CK、FOXP3 等高亲和力难洗脱抗体：35–40min

3、自然缓慢冷却至室温（严禁冷水急冲，抗原容易失活）

4、PBS 摇床洗涤 3 次 ×5min，进入下一轮封闭染色

✅优势：洗脱力度拉满，同源抗体无残留，大幅降低串色

注意：石蜡切片结构耐受高温，全程多轮染色优先热洗脱

骨组织除外（骨组织易掉片，不能用高温水浴的方式进行高温洗脱，建议用我司的抗体洗脱液RC-010洗脱）

 

冰冻新鲜组织切片｜禁用高温！只用 RC-010 洗脱液

❌致命避雷：高温水浴会直接导致整块切片脱落报废

✅标准操作

1、mIHC 洗脱液提前 37℃水浴预热

2、组织圈内铺满洗脱液，37℃孵育 5–20min，弃液

3、再次加满洗脱液二次孵育 5–20min，两次洗脱清除残留抗体

4、PBS 充分洗涤 3×5min

适配：脑组织、脂肪、穿刺新鲜冰冻样本

 

细胞爬片/细胞涂片｜仅能温和化学洗脱

细胞附着力极弱，高温会让细胞整片从玻片冲落

✅操作要点

1、37℃预热 RC-010 洗脱液全覆盖爬片

2、分两次短时间孵育，单次 5–15min，总时长不超过 30min

3、PBS 低速摇床轻柔洗涤，避免细胞脱落

避坑：洗脱超时会损伤细胞抗原，后续染色信号大幅减弱

 

三、两种洗脱方案优缺点直观对比

♆高温热洗脱（石蜡专属）

优点：洗脱彻底，清除高黏附抗体，背景干净，无需额外采购试剂

缺点：高温损伤脆弱样本，仅石蜡切片可用

♆RC-010 专用抗体洗脱液（冰冻/细胞）

优点：37℃全程温和，最大程度保护样本形态，几乎不掉片，不破坏抗原

缺点：CK 等高表达抗体需分两次孵育才能完全洗脱干净

 

四、高频痛点 & 一站式解决办法

痛点1：分不清什么时候用热洗脱/洗脱液，随便混用

速记口诀：硬石蜡（骨组织除外）加热洗，软薄脆样本用专用洗脱液

石蜡→95℃水浴热洗脱；冰冻/细胞爬片/细胞涂片→37℃抗体洗脱液（RC-010）化学洗脱

 

痛点2：多色通道严重串色、荧光互相溢出

排查洗脱问题：

1、石蜡切片水浴时间不足，延长至 30–40min

2、冰冻/细胞仅单次洗脱液孵育，需要按说明书要求分两次洗脱

3、难洗脱指标（CK、FOXP3）放在染色最后一轮，降低洗脱压力

 

痛点3：切片大面积掉片、组织碎裂

石蜡掉片：水浴后不可使用冷水急速降温，静置自然冷却

抗体洗脱时冰冻/细胞禁用高温水浴：使用抗体洗脱液（RC-010）温和化学洗脱

 

五、慧蓝 TSA 洗脱实操加分技巧

1、染色顺序匹配洗脱逻辑：难洗脱、低表达抗原放第一轮；高表达易串色蛋白放最后一轮

2、同批次同时处理石蜡+冰冻切片，两套洗脱体系分开操作，修复液不混用

3、洗脱完成必须充分PBS洗涤，残留洗脱液会抑制下一轮一抗结合

4、RC-010洗脱液常温避光保存，37℃预热后使用洗脱效果更佳

 

参考文献：

1. Fang W, Du X, Yang R, et al. Injectable therapeutic system incorporating neurogenesis-programmed stem cells concomitantly promoting muscle regeneration treats stress urinary incontinence[J]. Nat Commun. 2025 Sep 25;16(1):8404.
2. Sheng W, Mohiuddin TM, Zhang C, et al. A Customizable Tyramide Signal Amplification-Based Multiplex Immunofluorescence Protocol for FFPE Tissues[J]. Curr Issues Mol Biol. 2026;48(5):439.

结语：

• 很多人做多标 mIHC 只在意一抗、荧光显色，却忽略抗体洗脱这个承上启下的关键步骤。选错洗脱方式，前期样本、抗体、修复的全部努力都会付诸东流。这份区分3类样本的洗脱操作指南，完全贴合慧蓝 TSA 试剂盒官方标准流程，不管是刚上手的科研小白，还是反复踩串色、掉片坑的师兄师姐，都可以直接对照操作。实验无捷径，但找对方法就能少走弯路，希望大家看完这篇都能一次性做出干净、无串色、成像完美的多重荧光切片，顺利产出高质量实验图，投稿一路绿灯！

 

慧蓝生物助力广大科研客户提供一站式完整多重免疫荧光的整体解决方案。

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